Marcadores Tumorales

Biol. Blanca Santinelli Núñez
Coordinadora Sección de Marcadores Tumorales
Departamento de Laboratorio Clínico
Instituto Nacional de Cancerología México  

Dr. Eduardo Cervera Ceballos
Jefe Departamento de Laboratorio Clínico
Instituto Nacional de Cancerología México

Parte I

Definición, Clasificación y Metodologías Analíticas

• Introducción

En la actualidad el cáncer es un problema grave de salud, que representa la segunda causa de muerte en adultos en México y en países desarrollados(1). Aunado a ello, el aumento en la esperanza de vida y quizá algunos factores ambientales aún no bien definidos nos hacen suponer un incremento en el número de enfermedades malignas. Es de gran importancia resaltar el hecho de que el diagnóstico y manejo de las enfermedades oncológicas, conducen a enormes costos biológicos, sociales y económicos, tanto para el individuo, como para su familia y la sociedad entera.

El concepto más tradicional de la oncología clínica es que el diagnóstico temprano y el tratamiento oportuno aumentan las probabilidades de supervivencia y es tal vez la única estrategia que a nivel poblacional repercute en mejoría de los índices de curación y calidad de vida. De ahí, la necesidad de una prueba capaz de detectar el cáncer en el período mas temprano posible y ello permanece como uno de los más ambiciosos objetivos y paradigmas de la ciencia médica.

Desafortunadamente cáncer es un término que involucra más de 200 enfermedades distintas cuyo común denominador es la perversión del crecimiento celular en un órgano ó tejido. Aceptando el hecho de que hablamos de enfermedades diferentes en cuanto a su génesis, presentación, evolución, pronóstico y manejo, entonces debemos aceptar que cada tipo de cáncer requiere abordajes diagnósticos, terapéuticos y de monitoreo diferentes.

Debido a esto, la búsqueda de Marcadores Tumorales (MT) que indiquen la presencia de un proceso maligno representa un área activa en la investigación del cáncer.

En el presente trabajo abordaremos algunos de los conceptos más importantes respecto a los MT de mas uso en la práctica oncológica, sus métodos de medición, aspectos de control de calidad, investigación clínica y básica así como que es lo que a futuro se plantea en cuanto al estudio y utilización de los hoy llamados MT.

II. Definición

En un sentido muy amplio, Marcador de Enfermedades un indicador del riesgo, presencia, estado o comportamiento futuro de afección o procesos mórbidos, presentes o a desarrollar. Se establecen con fines de ayuda clínica en cuanto a la evaluación de la probabilidad de presentar una enfermedad dada en una población o bien la presencia de la misma en un individuo dado, su pronóstico o evolución clínica(2) En este sentido, los marcadores de enfermedad más comunes son los que en la anamnesis y exploración fisica el médico descubre. No obstante estos indicadores carecen de sensibilidad y especificidad, de allí que se requieran indicadores mas finos en cuanto a señalar con mayor precisión la presencia de un proceso mórbido.

Ya desde un punto de vista puramente oncológico, el término MT se refiere a una amplia categoría de sustancias ó procesos biológicos (hormonas, proteínas, enzimas, receptores, antígenos, etc) susceptibles de ser medidos y, que son sintetizadas y liberadas por las células cancerosas o por las células normales en respuesta a la presencia de un proceso maligno. Estas sustancias ó procesos, pueden ser determinados histológicamente en el tejido tumoral y se les conoce como MT celulares; o bien, pueden ser cuantificados en los líquidos corporales como suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etc. y, a éstos se les conoce como MT humorales (3,4). Entonces, el término acoge a un amplio espectro de moléculas con características ampliamente divergentes, pero que comparten la asociación con malignidad que facilita su aplicación en la detección y manejo de pacientes con cáncer.

Durante la primera mitad del siglo XX, la descripción histopatológica de los tejidos tumorales fijados en parafina fueron los primeros fundamentos del estudio de MT. Con el desarrollo de metodologías inmunológicas en los 60's y70's y el desarrollo de técnicas moleculares una y dos décadas después, se perfeccionó la capacidad de detectar cambios mas sutiles en cuanto a la respuesta y desarrollo tumoral (2). Al final del siglo XX, contamos con una gran cantidad de moleculas marcadoras, debiendo entonces definir aquellas con verdadera utilida clínica de aquellas que solo representan alguna "moda" o son mas "elegantes" o como algunos autores sugieren mas "sexis" en cuanto a su determinación y uso.

Para este propósito, los MT estudiados en este trabajo se referirán a aquellos cambios genéticos o bioquímicos que pueden ser identificados en contraparte de lo usual y convencionalmente considerado "normal" (5) y que representen una verdadera utilidad clínica.

Entonces no todo lo relacionado con alguna forma de cáncer puede ser denominado MT, para ello deberán cumplirse los siguientes requisitos (Tabla 1):

TABLA 1. Características definitorias de un marcado tumoral

1.- Sustancia o proceso producido por ó en respuesta a algún proceso maligno.

2.- Medible, cuantificable o distinguible por técnicas asequibles de laboratorio.

3.- Con una contraparte normal claramente definida.

4.- Con utilidad clínica demostrada:

• Pesquiza o tamizaje.
• Diagnóstico
• Pronóstico
• Monitoreo/Seguimiento

El primer concepto parte de la premisa de que se requiere de una molécula, sustancia o proceso biológico presente de manera anormal, en exceso o simple y llanamente de manera diferente, como parte del proceso maligno o como respuesta orgánica al mismo (5). Como ejemplo podemos citar el caso de la fracción beta de la hormona gonadotropina coriónica, la cual en condiciones normales es producida por el tejido sincicio-trofoblástico y placentario durante el embarazo normal. No obstante se encuentra elevada (en ocasiones en rangos de cientos de miles de unidades) en pacientes con diferentes formas de cáncer de células germinales y en pacientes con Enfermedad de Trofoblasto (6).

El segundo requisito es que el elemento a determinar pueda ser medido o cuantificable de manera tal que se establezca una clara distinción entre el campo de lo normal de lo patológico. Para productos o sustancias solubles y medibles en líquidos biológicos, el establecer valores de corte con los métodos estadísticos tradicionales, es usualmente suficiente (7). En algunos casos hay que establecer alguna subclasificación en cuanto a la propia elevación de algún MT dado, ya que valores mas o menos elevados pueden indicar pistas diagnósticas diferentes. El mejor ejemplo de ello lo representa la beta-2-microglobulina, estructura comprendida en la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad y que se eleva en algunas formas de linfoma y mieloma múltiple, no obstante, valores mas elevados se encuentran en las primeras patologías señaladas (linfomas) haciendo la salvedad que se puede elevar también en la insuficiencia renal y en ello pierde sensibilidad (8).

Otra característica es que la determinación y el proceso analítico deben ser claros y objetivos, reproducibles y es altamente deseable que sean reportados de manera lo mas uniforme posible (en cuanto a unidades de medición) que ayude a los clínicos a establecer comparaciones entre grupos de pacientes y también en el mismo paciente en diferentes momentos de su patología (6).

La contraparte normal debe ser indubitable, el resultado del proceso analítico debe claramente distinguir lo normal de lo que no lo es y en caso de no serlo así, el médico debe estar alerta de ese hecho (el profesional del laboratorio clínico debe así alertarlo) y evitar la toma de decisiones que conlleven riesgos innecesarios para el paciente (6).

La utilidad clínica de un MT dado, para una patología específicamente señalada, en una población dada (en cuanto a género, edad, etnicidad y otros factores de interés) debe conocerse de antemano, antes de que dicho marcador se aplique a la toma de decisiones diagnósticas y terapéuticas (7). Un error común en la práctica oncológica es atribuirle erroneamente utilidad clínica a un marcador dado y con base en ello tomar decisiones igualmente erroneas. Quizá el error mas común es atribuírle a un MT útil en el paciente ya diagnosticado con alguna forma de cáncer, valor en el tamizaje o pesquiza diagnóstica poblacional. Pongamos como ejemplo el caso del CA 19-9, altamente útil en el seguimiento y monitoreo de pacientes con algunas formas de cáncer de páncreas, pero absolutamente innnecesario como parte de un perfil diagnostico, prueba de rutina o tamizaje. Así pues el médico y el profesional de laboratorio clínico deben conocer a detalle cual es el verdadero valor de cada MT y su aplicación no puede ser intercambiable con otros fines. Las principales áreas de utilidad clínica de los MT son (2,5,7):

• Tamizaje o pesquiza diagnóstica: Se refiere a la valoración del riesgo o susceptibilidad a una enfermedad en sujetos sin la enfermedad o bien la detección temprana de la enfermedad, para los que ya la presentan pero que no habían sido así diagnosticados. Para este caso el ejemplo del antígeno prostático específico (APE) es uno de los mas adecuados.

• Diagnóstico: Establece la separación entre enfermedades benignas y malignas,o bién la diferencia entre un proceso maligno en particular, de otro. Para el caso de distinguir entre lesiones benignas y malignas de la próstata el APE es de gran utilidad y la Enolasa Neurona Específica (ENE) ayuda a disntingui entre variedades de células pequeñas y no pequeñas de cáncer pulmonar.

• Pronóstico: Es el establecer o predecir que tan bién o mal un paciente determinado respondera al tratamiento, recidivará, tiempo de supervivencia y otros parámetros de evolución clínica. Como ejemplos citamos los valores basales de CA-125 y alfa feto proteína (AFP), en los que a mayor elevación del marcador, peor el pronóstico para casos de cáncer epitelial de ovario y tumores germinales, respectivamente.

• Monitoreo/Seguimiento: Se refiere a la determianción repetida, seriada, que permita detectar signos tempranos de recaída (enfermedad residual mínima) u otros signos de actividad de la enfermedad o pregresión de la misma. Para ello, la mayor parte de los actuales MT humorales son empleados, siendo premisa importante que el marcador en cuestión hubiera estado elevado al diagnóstico inicial. En cáncer de mama el monitoreo con CA 15-3 es un ejemplo particularmente llamativo.

Los MT no son generalmente diagnósticos, no obstante pueden proveer información que contribuya al proceso diagnóstico, particularmente en pacientes seleccionados (por ejemplo los que son referidos a clínicas especializadas en oncología). Para las determinaciones pre-tratamiento en pacientes con sospecha de cáncer, la prsentación clínica usualmente sugerirá que MT puede ser la de mayor utilidad. El valor diagnóstico de un MT en particular también dependerá de la prevalencia de la enfermedad en el grupo poblacional a considerar y la sensibilidad y especificidad del MT, definida como sigue (6):

• Especificidad: Porcentaje de personas normales ó personas con procesos benignos, en los cuales un resultado negativo (o normal) sea obtenido. A mayor especificidad, menores falsos positivos.
• Sensibilidad. Porcentaje de resultados de la prueba en cuestión, los cuales son correctamente positivos (o anormales) en presencia de tumor o del proceso oncológico que se trate. A mayor sensibilidad, menores falsos negativos.

Así pues, los MT pueden ser de gran utilidad en el diagnóstico diferencial. Pero es importante recordar que ningún MT es completamente específico para algún tipo particular de malignidad (la elevación puede deberse a otro tipo de malignidad o incluso a algún trastorno benigno); además un resultado "normal" (o negativo) de un MT no necesariamente excluye malignidad o su recurrencia (2,7).

Está bien documentado que la determinación seriada de las concentraciones de MT post-tratamiento pueden proveer indicación temprana de recurrencia, algunas veces meses antes de que ello se haga clínicamente evidente (6).

También vale la pena recordar que existen numerosos tipos de cáncer para los cuales no se han descrito elementos trazadores que sirvan a modo de MT y los MT actuales no pueden ser usados de manera intercambiable, sino exclusivamente para el tipo tumoral, el uso clínico validado (seguimiento, diagnóstico, ect) y la población señalada (7). Para otros casos el resultado de MT solo agregará confusión y muy probablemente conlleven decisiones clínicas inapropiadas.

Los MT pueden clasificarse de diferentes maneras, de acuerdo al propósito, ya sea con base en su estructura o en cuanto a su función biológica. Habitualmente se agrupan en antígenos oncofetales, glucoproteínas, enzimas, hormonas, proteínas séricas y marcadores genéticos (4) (tabla 2).

Tabla 2 . Clasificación de los Marcadores Tumorales de más uso

Por otra parte, ningún MT alcanza el calificativo de “marcador

ideal”, entendiéndose como tal aquél que sea altamente específico y sensible, que muestre correlación entre sus valores y el tamaño del tumor así como con los resultados de la terapia antineoplásica y cuyo análisis sea económico, fácil y sensible. Desafortunadamente los MT descritos a la fecha no cumplen todos estos criterios, por lo que tienen aplicaciones limitadas en el diagnóstico y deben usarse con otras técnicas de diagnóstico, Su principal aplicación es el monitoreo de la actividad tumoral como respuesta al tratamiento, el pronóstico de la enfermedad (control de recaídas) y, recientemente se han empleado como blancos terapéuticos en la práctica clínica (3).

La determinación de MT, fue hasta hace muy poco, trabajo de laboratorios altamente especializados, pero con el desarrollo de inmunoensayos automatizados, se encuentran disponibles en muchos laboratorios de rutina. Los resultados son, en consecuencia, disponibles para médicos no especialistas, quienes pueden estar menos familiarizados con la interpretación clínica de algún MT dado. Esto, en conjunto con la presión administrativa de reducir costos y la necesidad clínica de practicar la medicina basada en evidencias, lleva al esfuerzo de repasar a detalle el como obtener los mejores resultados posibles. A continuación se describirán algunos de las metodologías analíticas de mas uso para la determinación de MT , con el fin de recordar los principios básicos en que se basan y, de éste modo poder interpretar correctamente los resultados.

Tradicionalmente, la mayoría de los métodos usan anticuerpos monoclonales y de inmunohistoquímica para identificar MT. Como ya se mencionó, estos métodos pueden usarse directamente en el tejido tumoral o en algún fluido corporal. Sin embargo, la cuantificación de MT en líquidos biológicos tiene la ventaja de permitir, con una toma de muestra sencilla, no invasiva , revelar a distancia la presencia de un proceso neoplásico y su evolución.

Haciendo un poco de historia sabemos que el primer MT conocido fue la proteína de Bence-Jones descrito en 1845 por el autor del mismo nombre y, que después (1889) se relacionó con el mieloma múltiple. Sin embargo, el valor diagnóstico de las sustancias presentes en la sangre en relación con los procesos malignos, se inicia alrededor de los años 30 (del siglo anterior) con la introducción de la bioquímica y los bioensayos. A pesar de la importancia de estos hallazgos, las técnicas empleadas para medir los MT no fueron del todo eficientes debido a que se basaban en cuantificaciones poco específicas.

La introducción de los inmunoensayos a partir de los años 50s, causó gran impacto en muchas áreas de la medicina debido a que su sensibilidad y especificidad permitió la cuantificación exacta de una amplia variedad de compuestos biológicamente importantes, entre ellos MT, que se encuentran en los tejidos o fluidos corporales en bajas concentraciones ( del orden de ng o pg/ml) (9,10). En las últimas décadas los inmunoensayos han adquirido un papel protagonista en el laboratorio clínico y, son cada día más frecuentes los sistemas automatizados que se incorporan para realizar este tipo de ensayos.

Los inmunoensayos abarcan una amplia variedad de técnicas de enlace, que emplean ligadores (anticuerpos generalmente) con especificidad estructural hacia la sustancia de interés, también llamada ligando, antígeno (Ag) o analito. Como su nombre indica, los inmunoensayos tienen como base una reacción inmunológica, en la que interactúan antígenos y sus correspondientes anticuerpos a través de fuerzas reversibles no covalentes (9,10) (Fig. 1).

Los inmunoensayos pueden dividirse en dos grandes categorías. En la primera la concentración de anticuerpos está limitada en relación a la concentración total de Ag en la mezcla de reacción (un ejemplo es el RIA típico). En la segunda categoría, la concentración de anticuerpos está en exceso en relación a la concentración total de antígenos (un ejemplo es el análisis inmunorradiométrico o IRMA). En ambos casos la cuantificación de Ag se basa en la determinación subsecuente de las fracciones libre y unida al anticuerpo. Para conocer la proporción de las fracciones libre y unida resultantes, se incorpora un “marca” ( entendiéndose como tal cualquier material que pueda medirse con precisión en cantidades pequeñas por métodos analíticos sensibles) ya sea en el Ag o en el Ac, molécula que a su vez se le conoce como trazador, pues nos va a permitir seguir el curso de la reacción inmunológica. Dentro de las moléculas trazadores más comunes encontramos a los isótopos radiactivos, las enzimas, las moléculas fluorescentes y las luminiscentes.

Una vez introducido el trazador y al finalizar la inmunorreacción, es necesario determinar la distribución de este entre la forma unida y la libre. Para lograr esto, generalmente se requiere que la fracción unida sea físicamente separada de la fracción libre. Sin embargo, este paso de separación no es esencial si uno de los componentes del sistema puede ser detectado en presencia del otro (11).

Por otra parte, hasta finales de los años 70s en los inmunoensayos fueron ampliamente utilizados los anticuerpos policlonales, los cuales se obtienen del sistema inmune de animales que, en respuesta a un Ag desconocido, forma varias líneas de células plasmáticas. Las células plasmáticas a su vez, producen diferentes anticuerpos que reaccionan con varios epítopes sobre el antígeno contra el cual se originaron. Por lo tanto, el suero policlonal contiene una variedad de anticuerpos similares pero no idénticos con diferentes especificidades para el antígeno. Este problema de especificidad de los anticuerpos policlonales provoca confusión del sistema analítico y contribuye, por lo tanto, a la inespecificidad de órgano y de tipo tumoral de los marcadores (10,11).

Enfrentados a este problema de especificidad dado por las limitantes tecnológicas de aquella época (en la que sólo se contaba con tecnología inmunométrica policlonal), muchos investigadores intentaron superar este obstáculo.

Un gran avance se logró a partir del momento en que pudo contarse en forma práctica con la tecnología para obtener Ac monoclonales desarrollados por Köler y Milstein en 1975. La tecnología del hibridoma desarrollada por estos autores, forma células híbridas a través de la fusión in vitro de células productoras de anticuerpos (linfocitos B), los cuales tienen la capacidad de formar un tipo específico de estos, con células tumorales del mieloma las cuales son inmortales. Ambas células se fusionan por exposición rápida al glicol de polietileno. De esta forma se transfiere la capacidad de las células plasmáticas para producir anticuerpos de un tipo específico (pero que son incapaces de desarrollarse en cultivos) a células del mieloma que sí pueden cultivarse y que producen anticuerpos indefinidamente. Los híbridos resultantes producen Acs altamente específicos, es decir reaccionan con un solo sitio antigénico y son completamente homogéneos, física, química e inmunológicamente. Los anticuerpos monoclonales, posteriormente, pueden ser cultivados por separado para producir cantidades abundantes de estos (10,11).

El uso de los anticuerpos monoclonales no solo aumentó la sensibilidad y principalmente la especificidad de los inmunoensayos, sino que, particularmente en el área de los MT permitió obtener anticuerpos altamente específicos contra un gran número de nuevos antígenos extraídos del tejido tumoral, hasta hace poco desconocidos, tal es el caso del antígeno del cáncer de ovario CA 125 (12).

Los inmunoensayos que con más frecuencia se emplean para medir MT se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Inmunoensayos de mas uso en la determinación de MT y sus marcas correspondientes 

En seguida se hará una breve descripción de estos métodos.

RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA)

Alrededor de los años 60s Berson y Yallow al estudiar el comportamiento in vivo de la insulina marcada con I 131, hicieron varias observaciones que condujeron al desarrollo del primer RIA. Desde entonces la aplicación del RIA como método altamente sensible y específico ha favorecido el avance tan importante que en las últimas décadas han tenido la endocrinología y la oncología, ya que se ha podido determinar con precisión la concentración de un gran número de sustancias como vitaminas, hormonas, MT, etc. (11,13).

Para llevar a acabo un RIA es necesario contar con un Ac altamente específico contra la sustancia que se desea medir (Ag no marcado) y un derivado marcado isotópicamente de dicha sustancia con alta pureza (Ag* marcado). El principio básico de este procedimiento es la competencia entre el Ag* marcado y en Ag no marcado por un número fijo y limitado de sitios de unión con el Ac. Como resultado de esta competencia, a medida que aumenta la cantidad de Ag no marcado, disminuye la cantidad de Ag* unido al Ac. Posteriormente se determina el porcentaje de radiactividad total que se encuentra unido al Ac o el que se encuentra libre, una vez que las dos fracciones han sido separadas. Finalmente para obtener la concentración de las muestras se compara la distribución de radiactividad obtenida en estas, con la observada en los estándares, previa linearización de la curva de calibración (11,13) (Fig. 2).

El marcador radiactivo que con más frecuencia se emplea en el RIA es el I 125 debido a su alta actividad específica, su fácil incorporación en la molécula y su fácil medición, debido a que sólo emite radiaciones gama (11).

El RIA tiene la ventaja de ser un método altamente sensible y específico, sin embargo su empleo está sujeto a reglamentación para el manejo y eliminación de desechos radiactivos.

ANÁLISIS INMUNORRADIOMÉTRICO (IRMA)

Esta técnica es diferente del RIA convencional, debido a que es el anticuerpo y no el antígeno el que se encuentra radiomarcado. El más común de los análisis inmunorradiométricos emplea dos anticuerpos presentes en exceso. El primer anticuerpo se encuentra atado a una fase sólida y se une al antígeno presente en la muestra. El segundo anticuerpo se dirige a un sitio distinto sobre el antígeno, a la vez que acarrea la marca, formando un complejo “sandwich”. Posteriormente se elimina el exceso de anticuerpos que no se unieron y, como se asume que todos los antígenos se unen al primer anticuerpo y que por cada antígeno se une un Ac marcado, la relación obtenida entre el trazador unido y la concentración de antígeno es lineal (10,11).

Este método experimenta una creciente demanda debido a la disponibilidad actual de anticuerpos monoclonales.

INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS

Se han desarrollado muchas alternativas para reemplazar los marcadores radiactivos que se emplean en el RIA o en el IRMA y, con esto, eliminar las desventajas relacionadas con la vida media corta de los radioisótopos y la licencia para manejar estos, aunque en muchos casos el costo es una reducción en la sensibilidad. La mayoría de estos procedimientos emplean, en lugar de isótopos radiactivos como marca, enzimas unidas al antígeno o al anticuerpo. A este tipo de ensayos se les conoce como inmunoenzimáticos (11).

Las enzimas más comunes empleadas como marca en los inmunoensayos son la fosfatasa alcalina de intestino de ternera y la peroxidasa de rábano picante.

A los inmunoensayos enzimáticos los podemos dividir en homogéneos y heterogéneos.

Homogéneos : este tipo de ensayos no requieren separación física del complejo unido (Ag-Ac) de la fase libre, debido a que la enzima o el substrato forman parte de la reacción. Generalmente la actividad enzimática se bloquea cuando el antígeno se une al anticuerpo.

Heterogéneos: la enzima siempre permanece activa por lo que es indispensable la separación física del complejo Ag-Ac de la fase libre antes de la cuantificación enzimática.

HOMOGÉNEOS

INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO MULTIPLICADO (EMIT)

El inmunoensayo enzimático multiplicado o EMIT es un ejemplo de la categoría de los homogéneos que se emplea para la medición de sustancias de bajo peso molecular. En este análisis el antígeno se conjuga con una enzima la cual permanece activa. La unión del anticuerpo con el complejo antígeno-enzima, inactiva esta enzima. Por otra parte, el antígeno libre de la muestra (o estándares) compite con el complejo Ag-enzima por el anticuerpo, lo que resulta en una actividad enzimática aumentada. Este tipo de inmunoensayos presenta menor sensibilidad debido al impedimento estérico que representa la enzima en la reacción antígeno-anticuerpo (11).

HETEROGÉNEOS

Dentro de esta categoría se encuentra el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima o ELISA introducido por Engvall y Perlmann. En estos ensayos generalmente se inmoviliza al anticuerpo en una fase sólida y el antígeno se marca con una enzima (o a la inversa). A diferencia de los ensayos homogéneos, la enzima siempre se encuentra activa, por lo que debe existir un paso de separación antes de que se mida la actividad enzimática. El substrato de la enzima es incoloro y desarrolla un producto de color después de la activación enzimática, el cuál es fácilmente detectable por un espectrofotómetro para obtener resultados cuantitativos. Los ensayos pueden ser caracterizados de acuerdo a la naturaleza del sistema empleado en dos tipos principales: competitivos y no competitivos (10,11):

COMPETITIVOS

Como su nombre indica, tienen como base la competencia entre el antígeno sérico y el antígeno marcado con una enzima, por una cantidad limitada de anticuerpos adheridos a la fase sólida; ambos antígenos se unen a los anticuerpos dependiendo de sus concentraciones relativas. Una vez que la reacción toma lugar, la fase sólida se lava con amortiguador para eliminar los antígenos que no se unieron. Después de la adición del substrato, la cantidad de producto que se forma por la actividad enzimática, es cuantificada por métodos fotométricos. La cantidad formada de color es inversamente proporcional al contenido de antígeno de la muestra sérica. Existe una variante a este método en el cual es el antígeno el que se encuentra atado a una fase sólida y el Ac marcado con una enzima. En este caso solo los anticuerpos que no se unieron al antígeno en solución (Ag sérico) se unen al Ag inmovilizado. La fase sólida que sostiene al complejo Ag-Ac marcado se lava antes de agregar el substrato. Nuevamente la cantidad formada de producto es inversamente proporcional al contenido de antígeno presente en la muestra sérica.

NO COMPETITIVOS (PRINCIPIO DEL “SANDWICH”)

El principio del “sándwich” generalmente se emplea en la cuantificación de antígenos que se conoce que tienen varios sitios de unión con el anticuerpo. En estos ensayos el antígeno del suero se une a un exceso de anticuerpos adheridos a la fase sólida. Como el antígeno tiene varios epítopes, también se une a otro anticuerpo en solución el cual está marcado con una enzima, lo que resulta en la formación de un complejo “sándwich” en el que el antígeno se encuentra entre dos anticuerpos. Después de eliminar, mediante un paso de lavado, los anticuerpos marcados que no se unieron, se adiciona el substrato y se determina fotométricamente la actividad enzimática resultante. La intensidad del color producido por la enzima, es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra sérica. Esta técnica se emplea para cuantificar antígenos grandes, como por ejemplo proteínas.

En general las técnicas de ELISA tienen varias ventajas:

• El marcaje es a base de enzimas en lugar de isótopos radiactivos, por lo tanto, este método no está sujeto a restricciones legislativas.
• Los métodos de cuantificación están comúnmente disponibles: la reacción es fácilmente detectable por espectrofotometría, por consiguiente, no son necesarios los contadores de radiaciones.
• La especificidad es muy alta debido al empleo de anticuerpos monoclonales.
• Los reactivos tienen una vida media relativamente larga y su costo no es muy alto.
• Su sensibilidad es a nivel de nanogramos (10 - 9 g ).
• Son fácilmente automatizables y se puede adaptar al espectrofotómetro un sistema de cómputo que facilita el manejo de datos y de desarrollo de la curva estándar.

En cuanto a sus desventajas se observa que las técnicas de ELISA tienen una menor precisión y sensibilidad que el RIA.

ENSAYO ENZIMÁTICO DE MICROPARTÍCULAS (MEIA).

La tecnología MEIA es una variante del método de ELISA, que emplea como fase sólida partículas submicrónicas recubiertas de anticuerpos específicos para la sustancia a analizar.

La reacción MEIA se lleva a cabo de la siguiente manera: el antígeno sérico se une al anticuerpo de las micropartículas y forma un complejo inmune. Este complejo es retenido en la matriz de fibra de vidrio de las celdas de reacción empleadas en esta técnica y posteriormente se procede a eliminar todos los componentes no unidos mediante un paso de lavado. Enseguida se adiciona un segundo anticuerpo marcado con enzima (fosfatasa alcalina) el cual se une al complejo inmune para formar un “sándwich”, en donde el antígeno sérico queda atrapado entre dos anticuerpos. Después de otro paso de lavado, se dispensa el substrato fluorescente de la enzima: el fosfato de 4-metilumbeliferil (MUP). La enzima cataliza la hidrólisis del fosfato del 4-metilumbeliferil para formar 4-metilumbeliferona (MU). Finalmente el sistema óptico del equipo mide la tasa de generación del producto fluorescente, el cual es directamente proporcional a la concentración de la sustancia a analizar de la muestra.

Debido al empleo de micropartículas como fase sólida (las cuales ofrecen mayor superficie de contacto y menor difusión entre el antígeno y el anticuerpo), esta técnica aumenta la cinética de los ensayos y éstos finalizan más rápido que los otros tipos de inmunoensayos enzimáticos.

INMUNOENSAYOS FLUORESCENTES

Otro tipo de inmunoensayos que no emplea marcadores radiactivos son los fluorescentes, los cuales se caracterizan por la presencia de una molécula fluorescente empleada para marcar un antígeno. Los fluoróforos comúnmente empleados son la fluoresceína, la rhodamina y la umbeliferona.

Un ejemplo de esta técnica es el inmunoensayo de polarización fluorescente o FPIA que combina el enlace competitivo y la polarización fluorescente.

El proceso de la reacción es el siguiente: la sustancia analizar (Ag) y el Ag marcado con fluoresceína compiten por ocupar los sitios de unión del anticuerpo. Si la muestra contiene una alta concentración de la sustancia a analizar, muchas moléculas de Ag marcado quedan libres para rotar. Al ser excitadas por la luz polarizada vertical, las pequeñas moléculas fluorescentes rotan rápidamente emitiendo la luz en muchos planos, lo que resulta en una disminución en la intensidad de la luz polarizada vertical. Por otro lado, si la muestra contiene muy baja concentración (o ninguna) de la sustancia a analizar, el antígeno marcado se une a los anticuerpos. Estas moléculas grandes rotan más despacio y emiten luz polarizada en el mismo plano vertical, lo que es detectado por el dispositivo óptico como un aumento de esta luz. El cambio en la intensidad de la luz polarizada es inversamente proporcional a la concentración de la sustancia a analizar de la muestra.

QUIMIOLUMINISCENCIA (DIRECTA)

Weeks y colaboradores en 1984 desarrollaron una nueva técnica basada en la quimioluminiscencia, la cual emplea como fase sólida micropartículas paramagnéticas recubiertas de anticuerpos específicos contra la sustancia a analizar y como marca el éster de acridina. Este ensayo es de tipo heterogéneo y, se caracteriza por la emisión de luz visible debido a una reacción química producida por la oxidación del éster de acridina empleado como marca. Se realizan ensayos tanto por competencia como por “sandwich”.

Las partículas paramagnéticas empleadas en estos ensayos ofrecen una máxima superficie de contacto (100 veces más que los métodos convencionales) y una rápida separación magnética, con una mínima unión inespecífica.

VENTAJAS

• Alta sensibilidad (femtogramos 10 - 15 g ).
• No emplea radiactividad.
• Los resultados son rápidos (generalmente a los 15 min).
• Equipos automatizados de fácil manejo.

QUIMIOLUMISCENCIA AMPLIFICADA (INDIRECTA)

Existe otro método quimioluminiscente, el cual emplea como marca una enzima, la fosfatasa alcalina que cataliza la hidrólisis del éster de fosfato del substrato adamantil diaxetano (el cual es un compuesto estable) para formar constantemente un anión inestable el cual produce una fuerte emisión de luz. Esta señal luminosa prolongada en lugar del relámpago de luz de los otros métodos quimioluminiscentes permite hacer numerosas lecturas con el consiguiente aumento en la precisión del ensayo.

La quimioluminiscencia (tanto directa como indirecta) representa una alternativa automatizada del RIA que no sacrifica la eficiencia del ensayo, por lo que es uno de los métodos de inmunoanálisis con mejor futuro inmediato en la práctica clínica habitual.

ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA

Está basada en la utilización de Rutenio marcado y de la Tripolylamina (TPA). Esta técnica emplea partículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina, a las cuales se une el primer anticuerpo marcado con biotina, el antígeno de la muestra se une a este anticuerpo y posteriormente un segundo anticuerpo marcado con rutenio se dirige a otro sitio sobre la molécula de antígeno (reacción tipo “sándwich”). Por último, las partículas magnéticas con el marcador unido fluyen a través de la celda de lectura donde son retenidas en el área de activación por un imán con el fin de registrar la emisión de luz generada. La emisión de luz del Rutenio es consecuencia de la aplicación de un voltaje a la solución de muestra, de tal modo que el rutenio trivalente es reducido a Rutenio divalente con la ayuda de un agente oxidante (TPA).

VENTAJAS

• Excelente estabilidad del marcaje con rutenio.
• Unión mediante estreptavidina-biotina a la fase sólida (la unión es tan fuerte como el enlace covalente).
• Generación de la señal controlada eléctricamente.
• Generación de múltiples fotones por molécula marcadora.

EMISIÓN DE CRIPTATOS AMPLIFICADA Y RESUELTA EN EL TIEMPO (TRACE)

Consiste en una transmisión de energía no radiactiva desde un donador fluorescente que es el criptato de europio hasta un aceptor fluorescente, el cual emite una señal amplificada y proporcional a la concentración de analito presente en el medio.

Para concluir esta primera parte, podemos señalar que a futuro esperamos que la mayor parte de las metodologías usadas en la determinación de MT serán con inmunoensayos totalmente automatizados, que agregarán objetividad, reproducibilidad e incrementarán el control de calidad en la fase analítica.

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